一、產(chǎn)品規(guī)格

產(chǎn)品名稱：活細(xì)菌/死細(xì)菌雙染試劑盒

品牌：普美生物

貨號(hào)：PMK2006

規(guī)格：40T/80T

二、產(chǎn)品基本介紹

以下步驟僅用作示例以指導(dǎo)科研人員開(kāi)展自身細(xì)菌樣本的染色。

一、培養(yǎng)條件和細(xì)菌懸液的制備

注意:用本試劑盒進(jìn)行細(xì)菌染色，務(wù)必要小心去除培養(yǎng)基殘留，因?yàn)椋怂岷推渌囵B(yǎng)基成分可能以不可預(yù)料的方式與SYTO 9和PI結(jié)合，導(dǎo)致染色結(jié)果發(fā)生不可接受的變動(dòng)。簡(jiǎn)單的一次清洗步驟通常足以去除培養(yǎng)基內(nèi)含的培養(yǎng)基成分干擾物殘留。不建議使用磷酸鹽清洗緩沖液，因此可能降低染色效率。

1.1 用營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)大腸桿菌(30ml) 使其生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期。

1.2 于10000xg離心10-15min，濃縮25ml細(xì)菌培養(yǎng)物。

1.3 吸走上清液，用2ml 0.85% NaCI或適當(dāng)緩)中液來(lái)重懸沉淀。

1.4 取1ml重懸菌液分別加入含20ml 0.85% NaCI或適當(dāng)緩)沖液的30-40ml商心管(用作活細(xì)菌)，或含20ml70%異丙醇的30-40ml離心管(用作殺死細(xì)菌).

1.5 兩管樣品于室溫孵育1h，每隔15min顛倒混勻一次。

1.6 兩管樣品于10000xg離心10-15min。

1.7 用20ml 0.85% NaCI或適當(dāng)緩沖液重懸沉淀，并且按照步驟1.6再離心一次。

1.8分別用10ml 0.85% NaCI或適當(dāng)緩沖液重懸兩管樣品。

1.9 分別取3ml菌液測(cè)定670nm的光密度(OD670)，用玻璃或丙烯酸酯比色皿(1cm路徑).

1.10 對(duì)于大腸桿菌的建議染色濃度，根據(jù)你的儀器類型(熒光顯微鏡、熒光光度經(jīng)、熒光酶標(biāo)儀)或流式細(xì)胞儀來(lái)參考相應(yīng)部分的染色條件。

二、染色條件的優(yōu)化

試劑盒內(nèi)的兩種染料都經(jīng)過(guò)平衡優(yōu)化，按照1:1的比例進(jìn)行混合用于絕大多數(shù)的樣本都能得到良好的區(qū)分活/死細(xì)菌。偶然情況下，兩種染料的混合比例需根據(jù)實(shí)際需求進(jìn)行優(yōu)化調(diào)整。比如:在待檢樣本中，綠色熒光太突出，建議要么降低SYTO 9濃度，要么提高PI濃度。為了全面優(yōu)化染色條件，建議測(cè)試梯度濃度的SYTO9，每一種濃度與梯度濃度的PI進(jìn)行組合染色。建議按照1ml細(xì)菌懸液加入3μl不同混合比率的染料預(yù)混液。

三、熒光顯微鏡操作步驟

活菌和死菌的熒光可能用標(biāo)準(zhǔn)的熒光素長(zhǎng)通濾片設(shè)置來(lái)同時(shí)觀察。替代方案的話，活菌(綠色熒光)和死菌(紅色熒光)可分別用熒光素和Texas Red帶通濾光片設(shè)置。

3.1 在微量離心管內(nèi)組合等量的組分A(SYTO 9)和組分B (PI)，混勻。

3.2 每1ml細(xì)菌懸液內(nèi)加入3μl染料預(yù)混液。按照建議的稀釋倍數(shù)，終得到的染色工作液內(nèi)含0.3% DMSO，更高濃度的DMSO可能對(duì)染色產(chǎn)生副效果。

3.3 混勻后室溫避光孵育15min。

3.4 吸5μl染色的細(xì)菌懸液到載玻片上，并蓋上18mm方形蓋玻片。

3.5 根據(jù)表1選擇熒光顯微鏡上合適的濾片來(lái)觀察。

四、熒光光度計(jì)操作步驟

4.1調(diào)整大腸桿菌懸液(活和殺死)使其密度為1x108個(gè)細(xì)菌/ml (~0.03 OD670)。

4.2 參考表1在1cm 玻璃、丙烯酸酯或石英熒光比色皿混勻五種不同比例的細(xì)菌懸液。每個(gè)樣本的總體積為3ml。

表1.熒光光度計(jì)法檢測(cè)活/死細(xì)菌所需不同比例活細(xì)菌和死細(xì)菌縣液的加量體積

• 活：死細(xì)菌比例	ml活細(xì)菌懸液	ml死細(xì)菌懸液
  0:100	0	3.0
  10:90	0.3	2.7
  50:50	1.5	1.5
  90:10	2.7	0.3
  100:0	3.0	0

  4在微量離心管內(nèi)分別加30ul組分A(SYTO 9) 和30ul組分B (PI)，混勻。

4.4 每組不同比例的細(xì)菌懸液內(nèi)加入9μl染料預(yù)混液(5個(gè)樣本x9μl =45μl總量)，用槍上下吹打數(shù)次使其混勻。

4.5 室溫避光孵育15min。

4.6熒光測(cè)定和數(shù)據(jù)分析

①用熒光光度計(jì)測(cè)定每組細(xì)菌懸液(Fcell) 的熒光發(fā)射光譜(激發(fā):470nm，發(fā)射:490-700nm);

②分別測(cè)定發(fā)射光譜在510-540nm (em1，綠色)和620-650nm (em2，紅色)的累積熒光，并計(jì)算累積熒光比值:RatioG/R=Fcell,em1/Fcell,em2

③以大腸桿菌懸液內(nèi)活細(xì)胞的占比為橫坐標(biāo)，以累積綠色熒光與紅色熒光比(RatioG/R)為縱坐標(biāo)，制圖。

五、熒光酶標(biāo)儀操作步驟

針對(duì)細(xì)菌懸液，用熒光酶標(biāo)儀的測(cè)定條件與熒光光度計(jì)的基本類似。如同熒光光度計(jì)的檢測(cè)步驟，染料濃度相同于熒光顯微鏡的建議濃度，綠/紅熒光比與活細(xì)菌相對(duì)數(shù)量呈正比。

5.1 調(diào)整大腸桿菌懸液(活和殺死)使其密度為2x108個(gè)細(xì)菌/ml(~0.06 OD670)。

5.2 參考表2在16x125mm高硼硅玻璃培養(yǎng)管內(nèi)混勻五種不同比例的細(xì)菌懸液(大腸桿菌)。每個(gè)樣本的總體積為2ml。

表2.熒光酶標(biāo)儀法檢測(cè)活/死細(xì)菌所需不同比例活細(xì)菌和死細(xì)菌懸液的加量體積

• 活：死細(xì)菌比例	ml活細(xì)菌懸液	ml死細(xì)菌懸液
  0:100	0	2.0
  10:90	0.2	1.8
  50:50	1.0	1.0
  90:10	1.8	0.2
  100:0	2.0	0

  5.3在微量離心管內(nèi)分別加6ul組分A(SYTO 9) 和6ul組分B(PI)，混勻。

5.4 通過(guò)將所有的12μl上述預(yù)混液加入2ml無(wú)菌的dH2O，混勻后制備2x染色混合液。

5.5 吸100ul細(xì)菌懸液混合物到平底96孔板的各孔內(nèi)，建議每個(gè)制備物做三個(gè)平行。96孔板的邊緣孔通常空置以避免假讀數(shù)。

5.6更換新的槍頭，每孔加入100μl 2x染色混合液，上下吹打使充分混勻。

5.7 室溫避光孵育15min。

5.8熒光測(cè)定和數(shù)據(jù)分析

①以~485nm為激發(fā)波長(zhǎng)，~530nm為發(fā)射波長(zhǎng)(emission 1，綠色)來(lái)測(cè)定每孔熒光;

②以~485nm為激發(fā)波長(zhǎng)，~630nm為發(fā)射波長(zhǎng)(emission 2，紅色)來(lái)測(cè)定每孔熒光;

③通過(guò)測(cè)定兩種發(fā)射波長(zhǎng)下的熒光強(qiáng)光，并計(jì)算熒光比值:RatioG/R=Fcell,em1/Fcell,em2

④以大腸桿菌懸液內(nèi)活細(xì)胞的占比為橫坐標(biāo)，以RatioG/R為縱坐標(biāo)，制圖。

三、品牌介紹

湖北普美生物科技有限公司成立于2022年，專注于生命科學(xué)領(lǐng)域的產(chǎn)品研發(fā)、生產(chǎn)與銷售。公司以“創(chuàng)新驅(qū)動(dòng)、品質(zhì)為先"為理念，致力于為科研人員提供高品質(zhì)的科研工具和技術(shù)支持，助力生命科學(xué)研究的發(fā)展。依托的科研團(tuán)隊(duì)和創(chuàng)新的生產(chǎn)技術(shù)，截至目前，公司已發(fā)表學(xué)術(shù)論文千余篇，擁有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的超過(guò)百項(xiàng)。普美生物建立有的生產(chǎn)和質(zhì)控體系，確保產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定可靠。公司主要產(chǎn)品涵蓋了分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、免疫學(xué)及生物化學(xué)等多個(gè)領(lǐng)域，滿足不同科研需求。此外，普美生物還積極與高校和科研機(jī)構(gòu)合作，共同推動(dòng)前沿技術(shù)的轉(zhuǎn)化與應(yīng)用。展望未來(lái)，湖北普美生物將繼續(xù)秉持“為科學(xué)家提供可信賴的科研工具"的宗旨，力求成為生命科學(xué)領(lǐng)域的企業(yè)。我們期待與*的科研機(jī)構(gòu)和合作伙伴攜手并進(jìn)，共同為人類健康與生命科學(xué)的進(jìn)步貢獻(xiàn)力量。

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